荷花花粉检测

莲别称荷花，是莲科(Nelumbonaceae)莲属(Nelumbo)的多年生挺水植物，是*古老的双子叶植物之一，目前仅存有美洲莲(Nelumbo lutea)和亚洲莲(N. nucifera)2个种。荷花集观赏、食用、药用等功能于一体，具有重要的文化价值、经济价值、生态价值[1-2]。
花粉是植物体上起生殖作用的雄配子体[3]，其活力直接影响到植物受精和结实过程，较高的花粉活力可以提高植物的结实率和育种成效。荷花花粉含有丰富的类黄酮，目前针对荷花药用价值的研究较多[4-5]，而对其活力的研究较少[6]。全世界目前已有的2 000多个荷花品种主要由中国和日本培育而成[7]，育种方法主要是自然杂交和人工杂交，少部分采用物理或化学诱变方法[8-10]，然而在荷花杂交过程中常出现不结实或结实率低的问题。因此，了解花粉活力情况对于荷花杂交育种过程至关重要，如不同种类的荷花花粉活力是否存在差异及差异多大，如何更有效地检测荷花的花粉活力，如何更有效地储藏花粉使其活力保存较长时间等问题目前尚不清楚。
离体培养法和染色法是测定植物花粉活力的常用方法，已经在百合[11]、牡丹[12]、巴旦木[13]、菊花[14]、君子兰[15]等植物中得到了广泛应用。本研究以不同资源荷花的花粉为试验材料，分别采用离体培养法、碘-碘化钾(I2-KI)染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法进行活力检测，以离体培养法作为参照，比较2种染色方法的测定结果，从而对不同资源荷花的花粉活力进行比较分析。
在对荷花进行人工杂交前，先对花粉活力进行准确有效的检测，选出花粉活力强的品种作为父本，进而选择合适的杂交母本，是保证杂交育种工作顺利开展和提高效率的重要条件。本研究期望得出有效、快速地检测荷花花粉活力的方法，从而筛选出花粉活力较高的荷花品种，为荷花新品种的高效培育奠定基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料
表1中的试验材料为取自上海辰山植物园国家荷花资源圃的11份不同资源的荷花，包括美洲莲、亚洲莲及亚美杂交莲，均为单瓣型(图1)，因考虑到单瓣型荷花雄蕊发育正常，花粉活力通常更高。试验材料采集时选择天气晴朗的08：00左右，选取开花第2天的荷花，荷花花蕾在开花前用种子袋套上，避免因蜜蜂采蜜导致授粉杂交。试验于2020年7—9月在上海辰山植物园中国科学院上海辰山植物科学研究中心的观赏植物资源及创新利用研究组247实验室内完成。

1.2 试验方法
1.2.1 花粉的收集 用一次性唇刷将花粉从花药上轻刷下来，放在培养皿中的硫酸纸上，盖上培养皿备用。

1.2.2 培养基的选择 影响花粉萌发的主要因素有蔗糖、硼酸等[16]。聚乙二醇(PEG)可以促进种子萌发[17]，也可以使花粉缓慢水合，从而较长时间地维持花粉膨压，对花粉萌发也有一定的促进作用[18-20]。由前期的试验结果可知，荷花在固体培养基上的萌发率较低，结合孙春青等的方法[21]，*终选用液体培养基。
为了得到适用于大多数荷花花粉萌发的培养基，设置PEG-4000(含量分别为0、10%、15%)、蔗糖(含量分别为0、5%、10%)、硼酸(含量分别为0、0.01%、0.02%)3个因素的3个水平，共设计15种组成不一的培养基(表2)，并选择3个荷花品种的花粉做培养基筛选试验，分别为粉霸王、易建莲、巨姚。分别将3个荷花品种的花粉撒于15种培养基上，在培养箱中于30 ℃培养4 h后，使用奥林巴斯BX43正置显微镜，在放大10倍的条件下观察花粉的萌发情况，统计萌发率。在离体培养法中，当花粉管的长度大于花粉粒的直径时视为萌发[22]。

1.2.3 离体培养法 配制培养基，将培养基置于干净的凹面载玻片上，取花粉均匀撒在培养基上，然后将其放入内置湿润滤纸的培养皿中，在培养箱中于30 ℃培养4 h后，镜检观察花粉的萌发情况，统计萌发率。每个处理设置3个重复，每个重复观察3个视野。

1.2.4 I2-KI染色法 配制I2-KI溶液(称量 0.2 g KI溶于8 mL蒸馏水中，充分溶解后，加入 0.1 g I2定容至30 mL，振荡使其充分溶解)于棕色滴瓶中，避光备用。取适量花粉于PCR管中，将PCR管用锡箔纸包裹避光，再向管中加入200 μL I2-KI 溶液，轻轻振荡混匀，然后在黑暗条件下染色5 min。滴2～3滴染色液于载玻片上，镜检观察，被染成蓝色的花粉视为有活力，未被染色的花粉则视为无活力。上述每个处理设置3个重复，每个重复观察3个视野。

1.2.5 TTC染色法 配制0.5%TTC溶液(称量0.05 g TTC溶于10 mL磷酸缓冲液中)于棕色滴瓶中，避光备用，溶液需现配现用。取适量花粉于PCR管中，将PCR管用锡箔纸包裹避光，再向管中加入200 μL TTC溶液，轻轻振荡混匀，然后放入 37 ℃ 培养箱中黑暗染色15 min。滴2～3滴染色液于载玻片上，镜检观察，被染成红色的花粉是有活力的，未被染色的花粉是无活力的。上述每个处理设置3个重复，每个重复观察3个视野。

1.3 数据处理
用Excel对数据进行统计分析。离体培养法的花粉活力计算公式：花粉萌发率=已萌发的花粉粒数/花粉粒总数×****；染色法的花粉活力计算公式：花粉染色率=已染色的花粉粒数/花粉粒总数×****。

2 结果与分析
2.1 培养基的筛选
如图2所示，在PEG-4000浓度为0的培养基上，1-1、1-2、1-3、1-4、1-5培养基中的花粉未萌发；在PEG-4000含量为15%的培养基上，3-2、3-3、3-4、3-5培养基中的花粉几乎未萌发(萌发率<1%)；在 PEG-4000含量为10%的培养基上，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5培养基中的花粉萌发情况较好。由此看出，适宜含量的PEG-4000确实可以提高荷花花粉的萌发率，但当含量过高时，反而会抑制其萌发。同时发现，蔗糖含量为0时，花粉的萌发率较高，蔗糖含量为5%、10%时，花粉的萌发率偏低，表明萌发率随着蔗糖含量升高而降低。而花粉萌发率在硼酸含量为0.02%的培养基上较高，在硼酸含量为0.01%的培养基上较低。在2-5培养基上，易建莲荷花品种的平均花粉萌发率*高。综合考虑，为了满足大多数荷花的花粉都能良好萌发且萌发条件一致，选择2-5培养基用于花粉萌发。
选择易建莲进行进一步的试验，然而由于2-5培养基的蔗糖含量为0，因此设定PEG-4000含量为10%、硼酸含量为0.02%，添加不同含量的蔗糖再次进行培养基试验。由表3可以看出，易建莲花粉在5种培养基上的萌发率随着蔗糖含量的升高而先升高后降低，在5-1培养基上达到*高值，为9.86%，说明一定浓度的蔗糖可以促进花粉萌发，但当蔗糖含量过高时，花粉萌发反而被抑制。*终选择5-1培养基作为测定荷花花粉活力的液体培养基，其配方：10%PEG-4000+0.02%硼酸+0.1%蔗糖。

2.2 2种染色法的观测效果
在本试验中，I2-KI染色法、TTC染色法均能对荷花的花粉进行有效染色(图3-B、图3-C)。在显微镜下，花粉形态清晰，但2种染色方法的着色区分度有较大差异。经I2-KI染色后，大多数荷花花粉均呈褐黑色或黄褐色，*少数有未着色的花粉粒。经TTC染色后，荷花花粉呈红色或淡红色，部分花粉粒未着色，易区分。

2.3 3种花粉活力检测方法的比较
用3种方法检测荷花花粉活力发现，离体培养法和TTC染色法检测得到的所有荷花花粉的活力均低于45%，而I2-KI染色法检测得到的荷花花粉活力均高于70%。
离体培养法使用前期试验得到的*适培养基来检测不同荷花的花粉活力。由图4可以看出，用离体培养法检测得到11种不同资源的荷花花粉萌发率均低于20.00%，其中单洒锦的花粉活力*高，为18.46%，黑龙江野生莲的花粉活力*低，为6.70%。
使用I2-KI染色法测定荷花花粉活力时，染色后的花粉呈褐黑色或黄褐色，在显微镜观察下发现其色差不明显，同时花粉着色率*高，仅有少数花粉未着色。因此，如果仅以着色率来表示花粉的活力，那么I2-KI染色法检测得到的不同荷花花粉的活力均超过70%(图5)，这与离体培养得到的结果严重不符，因此认为这种染色法不适合用于检测荷花花粉的活力。
使用TTC染色法测定荷花花粉活力时，不同荷花检测得到的花粉活力差别较大。由图6可以看出，越南莲的花粉活力*高，达到了43.39%，江溪红莲的花粉活力*低，为11.24%。与离体培养结果比较可知，TTC染色法测得的花粉活力明显偏高，此方法虽然容易操作，染色后花粉的着色情况容易区分，但是得到的结果普遍高于离体培养法，且与离体培养中得到的染色率比例不一致，不能准确反映花粉活力，因此该方法也不适用于荷花花粉活力的检测。

3 讨论与结论
花粉活力直接影响杂交授粉后卵子受精和结实率的结果，因此，杂交育种试验之前需要了解荷花花粉的活力，优先选择花粉活力高的品种作为父本，更利于新品种的成功培育[23-25]。测定花粉活力的方法较多，不同植物适用的检测方法不同。花粉活力检测多采用染色法，因其操作过程简易、试验耗时少、能在较短时间内测定花粉活力等优点而被应用于各种植物中。研究发现，大部分检测方法得到的花粉活力高于实际活力[3]。孙光玲等研究发现，花粉活力的测定以离体培养法更可靠[26]。于璐通过对不同番茄品种花粉活力的测定得出，TTC染色法比I2-KI染色法更适用[27]。王士泉对于四川牡丹同时使用亚历山大染色法、TTC染色法和I2-KI染色法进行花粉活力的测定，并对其结果进行比较，认为四川牡丹更适用I2-KI染色法[28]。詹妮等发现，用离体培养法、过氧化物酶法和I2-KI染色法检测的大叶相思的花粉活力无显著差异[29]。